附件：應(yīng)用于結(jié)直腸癌輔助診斷的微小核糖核酸（microRNA）檢測試劑非臨床研究審評要點（2025年第15號）.doc

應(yīng)用于結(jié)直腸癌輔助診斷的微小核糖核酸
（microRNA）檢測試劑非臨床研究
審評要點

本審評要點主要針對應(yīng)用于結(jié)直腸癌輔助診斷的微小核糖核酸（microRNA）檢測試劑的分析性能、陽性判斷值、穩(wěn)定性、主要原材料和生產(chǎn)工藝等研究過程，為體外診斷試劑注冊申請人和技術(shù)審評部門提供參考。

本審評要點是對應(yīng)用于結(jié)直腸癌輔助診斷的microRNA檢測試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用。若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進行充實和細化。

本審評要點是供注冊申請人和技術(shù)審評人員使用的指導(dǎo)性文件，但不包括審評審批所涉及的行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本審評要點。如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究資料和驗證資料。

本審評要點是在現(xiàn)行法規(guī)和標準體系以及當(dāng)前認知水平下制定，隨著法規(guī)和標準的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，相關(guān)內(nèi)容也將適時進行調(diào)整。

一、適用范圍

本要點適用于采用實時熒光PCR法，對人糞便樣本中的微小核糖核酸（microRNA）進行體外定性檢測的試劑。臨床用于對結(jié)直腸癌疑似患者的輔助診斷，不用于普通人群的腫瘤篩查。

二、注冊審查要點

（一）監(jiān)管信息

1.產(chǎn)品名稱及分類編碼

產(chǎn)品名稱應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》（國家市場監(jiān)督管理總局令第48號）及相關(guān)法規(guī)的要求，如微小核糖核酸（microRNA）檢測試劑盒（熒光PCR法）。根據(jù)《體外診斷試劑分類規(guī)則》，該產(chǎn)品按照第三類體外診斷試劑管理，分類編碼為6840。

2.其他信息還包括產(chǎn)品列表、關(guān)聯(lián)文件、申報前與監(jiān)管機構(gòu)的聯(lián)系情況和溝通記錄以及符合性聲明等文件。

（二）綜述資料

綜述資料主要包括概述、產(chǎn)品描述、預(yù)期用途、申報產(chǎn)品上市歷史及其他需說明的內(nèi)容。建議以圖文結(jié)合的形式詳細說明產(chǎn)品所采用的技術(shù)原理及檢測流程，包括但不限于RNA提取、反轉(zhuǎn)錄前處理、反轉(zhuǎn)錄引物設(shè)計（如莖環(huán)結(jié)構(gòu)等）、擴增引物探針設(shè)計原理等。如試劑盒中存在防污染體系，應(yīng)進行說明。對于陽性判斷值需計算后進行判讀的產(chǎn)品，應(yīng)詳述計算原理、模型選擇和判讀規(guī)則。與已上市同類產(chǎn)品進行比較，比較內(nèi)容包括樣本類型、檢測原理、檢測靶基因、判讀規(guī)則、分析性能和臨床性能等。

預(yù)期用途中明確產(chǎn)品檢測的基因。詳述基因選擇標準及選擇過程，提供相關(guān)指南或文獻；同時提供文獻中待檢基因在其他腫瘤中的表達情況，并分析所檢測基因的靈敏度和特異性是否符合臨床需求。

如為多靶標檢測產(chǎn)品，應(yīng)分析多靶標檢測的靈敏度和特異性是否符合臨床需求。

明確產(chǎn)品預(yù)期人群，例如年齡和體征等指標。

（三）產(chǎn)品技術(shù)要求及檢驗報告

注冊申請人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)產(chǎn)品研制、前期評價等結(jié)果，依據(jù)國家標準、行業(yè)標準及有關(guān)文獻資料，結(jié)合產(chǎn)品特性按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》（2022年第8號）的要求編寫。該類產(chǎn)品作為第三類體外診斷試劑，應(yīng)當(dāng)以附錄形式明確主要原材料（包括企業(yè)參考品）以及生產(chǎn)工藝要求。

如有國家標準品，技術(shù)要求中應(yīng)體現(xiàn)國家標準品的相關(guān)要求，并使用國家標準品對三批產(chǎn)品進行檢驗。

如有適用的國家標準、行業(yè)標準，產(chǎn)品技術(shù)要求的相關(guān)要求應(yīng)不低于相應(yīng)的要求。

（四）分析性能研究

注冊申請人應(yīng)采用在符合質(zhì)量管理體系的環(huán)境下生產(chǎn)的試劑盒進行所有分析性能研究，提交具體研究方法、試驗方案、試驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析等詳細資料。

如果試劑適用不同的機型，需要在不同機型上分別進行分析性能評估。應(yīng)采用一個或多個機型，進行充分的試劑分析性能建立研究，對于其他機型，應(yīng)分析各適用機型的工作原理、檢測方法、反應(yīng)條件控制、信號處理等，如基本相同，可基于風(fēng)險分析對已建立的分析性能指標進行合理驗證。所有適用機型驗證的分析性能應(yīng)基本一致，如不同機型對某一檢測項目的某一分析性能存在差異，應(yīng)針對該差異采用不同機型進行充分的分析性能建立研究。

如申報產(chǎn)品包含不同包裝規(guī)格，需對各包裝規(guī)格間的差異進行分析或驗證。如不同規(guī)格間存在性能差異，需采用每個包裝規(guī)格產(chǎn)品進行分析性能評估；如不同規(guī)格間不存在性能差異，需要詳細說明各規(guī)格間的差別及可能產(chǎn)生的影響，采用具有代表性的包裝規(guī)格進行分析性能評估。

分析性能評估所用樣本應(yīng)盡量與預(yù)期適用的真實臨床樣本一致。如特定低濃度的樣本難以獲得，可采用不同濃度的樣本及陰性樣本進行混合研究；必要時，如使用人工基質(zhì)進行稀釋，應(yīng)考慮其基質(zhì)效應(yīng)。應(yīng)提供樣本基本信息，如樣本來源、樣本類型、稀釋方式、定值過程及數(shù)據(jù)等。

建議著重對以下分析性能進行研究。

1.反應(yīng)體系

1.1樣本采集和處理

根據(jù)適用樣本類型，進行樣本采集研究。提供樣本采集器具和保存液等的詳細研究資料，對配套的每種保存液均需驗證檢出限和重復(fù)性。

1.2核酸提取、反轉(zhuǎn)錄和擴增反應(yīng)體系

研究確定最佳核酸提取、反轉(zhuǎn)錄和擴增反應(yīng)體系，包括核酸提取方法與過程、提取用樣本體積/重量、洗脫體積、RNA濃度、DNA去除（如有）、反轉(zhuǎn)錄和擴增模板量、酶用量（如有）/各種試劑加樣體積及反應(yīng)各階段溫度、時間、循環(huán)數(shù)等。

提交不同適用機型基線和閾值循環(huán)數(shù)的確定資料。

不同適用機型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述，并提交驗證資料。

2.樣本穩(wěn)定性

對采集后各階段的樣本進行穩(wěn)定性研究，研究內(nèi)容包括保存條件、保存時間，凍融次數(shù)等。建議對每種保存液均進行穩(wěn)定性研究。

如核酸提取產(chǎn)物或反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可不立即進行檢測，還需對核酸提取產(chǎn)物或反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的保存條件和穩(wěn)定性進行研究。

3.樣本適用性

產(chǎn)品適用的樣本類型為人糞便樣本。建議根據(jù)布里斯托（Bristol）大便分類法收集主要型別的糞便樣本及其他可能影響檢測結(jié)果的糞便樣本類型（如黏液便、膽汁便），分別進行研究。對不適用糞便類型應(yīng)在說明書明示。

4.核酸提取/純化性能

糞便樣本中存在大量干擾物質(zhì)。核酸提取/純化步驟的目的除最大量分離出RNA外，還有相應(yīng)的純化作用，應(yīng)盡可能去除PCR抑制物。對配合使用的所有核酸提取試劑進行提取核酸純度、濃度、提取效率的研究。若產(chǎn)品適用兩種或以上核酸提取試劑，則每一種核酸提取試劑均需配合檢測試劑進行抗干擾、重復(fù)性和檢出限的驗證。

5.準確度

建議采用申報試劑與已上市產(chǎn)品或其他對比方法同時檢測臨床樣本比較檢測結(jié)果之間的一致性程度。研究應(yīng)包括一定數(shù)量的陰性、陽性樣本，并納入不同病理分期樣本和干擾樣本。

6.精密度

采用三批試劑對可能影響檢測精密度的主要變量進行驗證，應(yīng)考慮運行、時間、操作者、儀器、試劑批次和試驗地點等影響精密度的條件，設(shè)計合理的精密度試驗方案進行評價。精密度評價試驗應(yīng)包含核酸提取步驟。

應(yīng)至少包含3個水平：陰性樣本、弱陽性樣本、中/強陽性樣本，并根據(jù)產(chǎn)品特性設(shè)定適當(dāng)?shù)木芏纫?，例如?/p>

陰性樣本：樣本檢測結(jié)果均應(yīng)為陰性。

弱陽性樣本：結(jié)直腸癌患者樣本，待測物濃度為試劑盒陽性判斷值對應(yīng)的靶基因濃度，靶基因Ct值的CV≤5%。

中/強陽性樣本：結(jié)直腸癌患者樣本，待測物濃度呈中度到強陽性，陽性檢出率為100%且靶基因Ct值的CV≤5%。

7.分析特異性

7.1交叉反應(yīng)

7.1.1生物信息學(xué)分析

采用生物信息學(xué)分析方法進行研究，應(yīng)當(dāng)包括人基因組、糞便常見microRNA和糞便微生物組。

7.1.2 樣本驗證

樣本基質(zhì)應(yīng)與預(yù)期檢測樣本類型一致，交叉反應(yīng)研究用樣本主要考慮以下幾方面：

其他惡性腫瘤患者尤其是其他部位消化道惡性腫瘤患者（如食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、膽管癌等）糞便樣本、消化道良性疾病患者（如炎癥性腸病、消化性潰瘍、結(jié)直腸腸息肉等）糞便樣本；

其他糞便常見microRNA、待檢基因同源基因或待測靶標的相似序列microRNA。

7.2干擾研究

應(yīng)根據(jù)所采集樣本類型，針對可能存在的內(nèi)源/外源物質(zhì)干擾情況進行驗證。建議申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進行試驗，采用至少包含弱陽性水平在內(nèi)的樣本。對結(jié)果進行合理的統(tǒng)計分析，對比添加干擾物質(zhì)前后的 Ct 值差異；如為多靶標檢測產(chǎn)品，還應(yīng)比較綜合計算后的結(jié)果差異。檢測的潛在干擾物包括樣本中的原有物質(zhì)及在樣本采集和處理期間引入的物質(zhì)。

常見內(nèi)源性干擾物質(zhì)：血紅蛋白、膽紅素、白細胞、血清白蛋白、多糖等。

常見外源性干擾物質(zhì)：維生素C、膳食纖維、消化道疾病常用藥物（通便靈、西咪替丁等H2受體拮抗劑；奧美拉唑等質(zhì)子泵抑制劑、硫糖鋁等胃黏膜保護劑；乳酸桿菌等胃腸道益生菌、嗎丁啉等促胃腸動力藥、胰酶等消化酶補充劑）。

8.檢出限

8.1檢出限的確定

將不同來源的至少3個樣本梯度稀釋于與適用樣本一致的基質(zhì)中，進行檢出限的確定。每個濃度梯度最少重復(fù)3次檢測，以100%可檢出的最低濃度水平作為估計檢出限，在此濃度附近制備若干梯度濃度樣本，每個濃度至少重復(fù)20次檢測，將具有95%陽性檢出率的最低濃度水平作為確定的檢出限。

8.2檢出限的驗證

選擇另外3個不同來源的樣本在檢出限濃度水平進行驗證，應(yīng)達到95%陽性檢出率。

如包括多個檢測靶標，應(yīng)分別進行研究。

9.企業(yè)參考品驗證

根據(jù)主要原材料研究資料中的企業(yè)參考品設(shè)置情況，采用三批產(chǎn)品對企業(yè)參考品進行檢驗并提供詳細的試驗數(shù)據(jù)。

（五）穩(wěn)定性研究

申報試劑的穩(wěn)定性主要包括實時穩(wěn)定性（有效期）、使用穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請人可根據(jù)實際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括具體的實施方案、詳細的研究數(shù)據(jù)以及統(tǒng)計分析結(jié)論。對于實時穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批產(chǎn)品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

（六）陽性判斷值研究

單靶標檢測的申報產(chǎn)品，陽性判斷值一般為申報產(chǎn)品檢測靶標陽性的Ct值。如申報產(chǎn)品需通過多個靶標計算后進行判讀，申請人應(yīng)詳述計算模型選擇依據(jù)、計算過程、權(quán)重系數(shù)等。

陽性判斷值研究用樣本來源應(yīng)具有多樣性和代表性，考慮不同時間、地域、不同的生理狀態(tài)等因素。應(yīng)根據(jù)結(jié)直腸癌輔助診斷的預(yù)期用途，納入相關(guān)預(yù)期人群，包括不同病理分期的結(jié)直腸癌患者、不同種消化道良/惡性腫瘤疾病干擾樣本，并盡量納入較多弱陽性和高陰性水平的樣本。采用ROC曲線分析建立陽性判斷值，并確定產(chǎn)品的判讀規(guī)則。如判定值存在灰區(qū)，應(yīng)提供灰區(qū)的確認資料。

提交陽性判斷值研究所用樣本的背景信息列表，至少包括性別、年齡、臨床診斷信息、樣本來源機構(gòu)、檢測結(jié)果等信息。

提供內(nèi)標檢測結(jié)果范圍的確定方法和研究資料。

（七）其他非臨床研究資料

1.主要原材料研究

該類產(chǎn)品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTP、核酸分離/純化組分（如有）、質(zhì)控品、企業(yè)參考品等。應(yīng)提供主要原材料的選擇與來源、制備過程、質(zhì)量控制標準等相關(guān)研究資料、質(zhì)控品的定值試驗資料等。如主要原材料為企業(yè)自制，應(yīng)提供其詳細制備過程；如主要原材料源于外購，應(yīng)提供資料包括：選擇該原材料的依據(jù)及對比篩選試驗資料、質(zhì)量標準、出廠檢驗報告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗資料。生產(chǎn)商應(yīng)固定，不得隨意更換。

1.1引物和探針：microRNA長度短、序列相似度高，在引物/反轉(zhuǎn)錄引物、探針設(shè)計時應(yīng)充分考慮microRNA結(jié)構(gòu)特點。詳述靶標或靶標組合的選擇過程，對于多靶標組合產(chǎn)品應(yīng)盡可能保持彼此間的差異性，提高探針的特異性。詳述引物和探針的設(shè)計原則，提供引物、探針核酸序列、靶序列的基因位點及兩者的對應(yīng)情況。反轉(zhuǎn)錄引物應(yīng)結(jié)合結(jié)構(gòu)圖（如莖環(huán)結(jié)構(gòu)），詳述各部位序列、作用及反轉(zhuǎn)錄過程中結(jié)構(gòu)變化等情況。通過篩選確定最佳的引物和探針組合。引物、探針的質(zhì)量標準應(yīng)至少包括序列準確性、純度、濃度及功能性實驗等。

1.2脫氧三磷酸核苷（dNTP）：包括dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP，應(yīng)提供對其純度、濃度、功能性等的詳細驗證資料。

1.3酶：需要的酶主要包括核糖核酸酶H（RNase H）、RNA依賴的DNA聚合酶、DNA依賴的DNA聚合酶、尿嘧啶DNA糖基化酶等，應(yīng)分別對酶活性、熱穩(wěn)定性、功能性等進行評價和驗證。

1.4質(zhì)控品

試劑盒一般包含陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品。陽性質(zhì)控品應(yīng)包含試劑盒檢測的靶序列。質(zhì)控品需參與樣本處理、核酸的平行提取和檢測的全過程，以對整個提取和PCR擴增過程、試劑/設(shè)備、交叉污染等環(huán)節(jié)進行合理質(zhì)量控制。提交試劑盒質(zhì)控品有關(guān)原料選擇、制備、定值過程、濃度范圍等試驗資料，對質(zhì)控品的檢測結(jié)果Ct值范圍做出明確的要求。如為多靶標檢測產(chǎn)品，還應(yīng)對綜合計算后的結(jié)果范圍做出明確的要求。

1.5內(nèi)標

內(nèi)標，又稱內(nèi)對照，可對檢驗過程進行質(zhì)量控制，應(yīng)與靶核酸一同提取及擴增。應(yīng)詳述內(nèi)標基因的選擇。申請人需對內(nèi)標的引物、探針設(shè)計和相關(guān)反應(yīng)體系的濃度做精確驗證，既要保證內(nèi)標熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制。明確內(nèi)標的檢測結(jié)果Ct值范圍。建議科學(xué)設(shè)置內(nèi)標，對待測樣本的取樣質(zhì)量、試劑的反應(yīng)體系進行監(jiān)控。

1.6核酸擴增反應(yīng)液（如適用）

如申請人選擇包含多組分的商用核酸擴增反應(yīng)液，應(yīng)提交不同商用核酸擴增反應(yīng)液的選擇、驗證研究資料，并明確核酸擴增反應(yīng)液的質(zhì)量標準。

1.7 其他

試劑盒中其他生物活性物質(zhì)，如RNA酶抑制劑、DNA去除劑等，應(yīng)分別明確其質(zhì)量標準并進行驗證。

1.8企業(yè)參考品制備

申請人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品性能驗證的實際情況自行設(shè)定企業(yè)內(nèi)部參考品，包括陽性參考品、陰性參考品、檢出限參考品、精密度參考品。參考品可采用臨床樣本、細胞系，基質(zhì)一般為真實糞便樣本。如特定低濃度的樣本難以獲得，可采用不同濃度的樣本及陰性樣本進行混合研究；必要時，如使用人工基質(zhì)進行稀釋，應(yīng)考慮其基質(zhì)效應(yīng)。應(yīng)提交企業(yè)參考品的原料來源、選擇、制備、陰陽性及濃度確認方法或試劑等相關(guān)驗證資料。

陽性參考品應(yīng)包含不同濃度水平靶基因的結(jié)直腸癌糞便樣本。

陰性參考品應(yīng)包含易發(fā)生交叉反應(yīng)的其他良惡性疾病糞便樣本及干擾物質(zhì)、待測靶標序列相似的microRNA。

檢出限參考品應(yīng)包含所有靶基因檢出限水平或略高于檢出限的水平。

精密度參考品應(yīng)選擇代表性靶基因，并包括高、低兩個濃度的樣本，低濃度應(yīng)為陽性判斷值對應(yīng)的靶基因濃度。

2.生產(chǎn)工藝研究資料

介紹產(chǎn)品主要生產(chǎn)工藝，可用流程圖結(jié)合文字的方式表述。提交主要生產(chǎn)工藝的確定及優(yōu)化研究資料。