附件：猴痘病毒核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)審查指導(dǎo)原則（2024年第10號(hào)）.doc

猴痘病毒核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)審查指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)猴痘病毒核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門提供參考。

本指導(dǎo)原則是對(duì)猴痘病毒核酸檢測(cè)試劑的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用。若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是供注冊(cè)申請(qǐng)人和技術(shù)審評(píng)人員使用的指導(dǎo)性文件，但不包括審評(píng)審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。

一、適用范圍

本指導(dǎo)原則適用于采用實(shí)時(shí)熒光PCR法，對(duì)皮膚病變樣本（包括皮疹表面和/或滲出物的拭子；痘皰液；痘痂或痘皰皮膚黏膜樣本等）、咽拭子、血液等樣本中的猴痘病毒核酸進(jìn)行體外定性檢測(cè)的試劑。

對(duì)于采用其他方法學(xué)的猴痘病毒核酸檢測(cè)試劑，可能部分要求不完全適用或本文所述內(nèi)容不夠全面，申請(qǐng)人應(yīng)參照本指導(dǎo)原則，根據(jù)產(chǎn)品特性對(duì)適用部分進(jìn)行評(píng)價(jià)，并補(bǔ)充其他的評(píng)價(jià)資料。

本指導(dǎo)原則適用于猴痘病毒核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)申請(qǐng)和變更注冊(cè)申請(qǐng)的情形。本指導(dǎo)原則針對(duì)猴痘病毒核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料中的部分內(nèi)容進(jìn)行撰寫，其他未盡事宜應(yīng)當(dāng)符合《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》等相關(guān)法規(guī)要求，同時(shí)建議參考《定性檢測(cè)試劑分析性能評(píng)估注冊(cè)審查指導(dǎo)原則》等適用的技術(shù)文件要求。

二、注冊(cè)審查要點(diǎn)

（一）監(jiān)管信息

1.產(chǎn)品名稱及分類編碼

產(chǎn)品名稱應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊(cè)與備案管理辦法》及相關(guān)法規(guī)的要求，如猴痘病毒核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）。根據(jù)《體外診斷試劑分類規(guī)則》，該產(chǎn)品按照第三類體外診斷試劑管理，分類編碼為6840。

2.其他信息還包括產(chǎn)品列表、關(guān)聯(lián)文件、申報(bào)前與監(jiān)管機(jī)構(gòu)的聯(lián)系情況和溝通記錄以及符合性聲明等文件。

（二）綜述資料

綜述資料主要包括概述、產(chǎn)品描述、預(yù)期用途、申報(bào)產(chǎn)品上市歷史及其他需說(shuō)明的內(nèi)容。應(yīng)詳細(xì)說(shuō)明產(chǎn)品所采用的技術(shù)原理及檢測(cè)流程。提供不同適用機(jī)型的檢測(cè)通量，即一次檢測(cè)最多可檢測(cè)的樣本數(shù)。提供核酸提取（手工和自動(dòng)提取方式應(yīng)分別明確）和PCR擴(kuò)增的時(shí)間，以及檢測(cè)全過(guò)程所需的時(shí)間。不同檢測(cè)流程，分別提供最少和最多檢測(cè)樣本量下的檢測(cè)時(shí)間。與已上市同類產(chǎn)品進(jìn)行比較，比較內(nèi)容包括樣本類型，檢測(cè)原理，檢測(cè)靶基因，組成成分，內(nèi)標(biāo)，對(duì)照品，判讀規(guī)則，分析性能和臨床性能等。

預(yù)期用途中明確產(chǎn)品檢測(cè)的靶基因，需選擇保守性和特異性相對(duì)較高的基因，同時(shí)還應(yīng)考慮基因的擴(kuò)增效率。檢測(cè)基因的選擇應(yīng)提供相關(guān)指南或文獻(xiàn)，并分析所檢測(cè)基因的靈敏度和特異性是否符合臨床需求。

（三）非臨床資料

1.分析性能研究

注冊(cè)申請(qǐng)人應(yīng)采用在符合質(zhì)量管理體系的環(huán)境下生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行所有分析性能研究，提交具體試驗(yàn)方案、試驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析等詳細(xì)資料。

分析性能評(píng)估所用樣本的基本信息均需明確，例如樣本來(lái)源、樣本類型、采集和處理方式、稀釋方式、定值過(guò)程及數(shù)據(jù)等。研究中采用的猴痘病毒陽(yáng)性樣本，應(yīng)采用科學(xué)合理的方法確定其陰陽(yáng)性和濃度水平，提交具體的試驗(yàn)資料。分析性能評(píng)估用樣本一般應(yīng)為真實(shí)樣本，包括臨床樣本和病毒培養(yǎng)物，可采用境內(nèi)外樣本進(jìn)行研究。如涉及稀釋后檢測(cè)，應(yīng)采用與適用樣本類型一致的陰性基質(zhì)。不可采用質(zhì)粒等進(jìn)行分析性能評(píng)估。精密度、檢出限和包容性研究中所用樣本應(yīng)相互獨(dú)立。

1.1樣本穩(wěn)定性

對(duì)采集后各階段的樣本進(jìn)行穩(wěn)定性研究，包括不同保存液、裂解液，不同滅活方式處理后的樣本，研究?jī)?nèi)容包括冷藏保存時(shí)間，冷凍保存時(shí)間，凍融次數(shù)等。

建議對(duì)每種樣本類型均進(jìn)行穩(wěn)定性研究，研究樣本應(yīng)至少包含陰性樣本、弱陽(yáng)性樣本和中/強(qiáng)陽(yáng)性樣本。

如核酸提取液不立即進(jìn)行檢測(cè)，還需對(duì)核酸提取液的保存條件和穩(wěn)定性進(jìn)行研究。

1.2適用的樣本類型

列明產(chǎn)品適用的樣本類型，對(duì)皮膚病變樣本（包括皮疹表面和/或滲出物的拭子；痘皰液；痘痂或痘皰皮膚黏膜樣本等）、咽拭子、血液等應(yīng)分別進(jìn)行分析性能評(píng)估。

1.3企業(yè)參考品驗(yàn)證（如適用）

根據(jù)主要原材料研究資料中的企業(yè)參考品設(shè)置情況，采用三批產(chǎn)品對(duì)企業(yè)參考品進(jìn)行檢驗(yàn)并提供詳細(xì)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.4準(zhǔn)確度

可采用方法學(xué)比對(duì)或參考品（盤）檢測(cè)的方法進(jìn)行研究。

1.5精密度

應(yīng)對(duì)精密度指標(biāo)，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)等的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求。應(yīng)考慮運(yùn)行、時(shí)間、操作者、儀器、試劑批次和地點(diǎn)等影響精密度的條件，設(shè)計(jì)合理的精密度試驗(yàn)方案進(jìn)行評(píng)價(jià)。精密度評(píng)價(jià)試驗(yàn)應(yīng)包含核酸提取步驟。設(shè)定合理的精密度評(píng)價(jià)周期，例如為期至少20天的檢測(cè)。對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，獲得重復(fù)性、中間精密度、再現(xiàn)性結(jié)果。

應(yīng)采用臨床樣本或病毒培養(yǎng)物進(jìn)行精密度評(píng)價(jià)，并至少包含3個(gè)水平：陰性樣本、臨界陽(yáng)性樣本、中/強(qiáng)陽(yáng)性樣本，并根據(jù)產(chǎn)品特性設(shè)定適當(dāng)?shù)木芏纫?，例如?/p>

陰性樣本：不含待測(cè)物，陰性符合率應(yīng)為100%（n≥20）。

臨界陽(yáng)性樣本：待測(cè)物濃度略高于試劑盒的檢出限，陽(yáng)性檢出率應(yīng)≥95%（n≥20）。

中/強(qiáng)陽(yáng)性樣本：待測(cè)物濃度呈中度到強(qiáng)陽(yáng)性，陽(yáng)性檢出率為100%且Ct值的CV≤5%（n≥20）。

1.6包容性

1.6.1采用生物信息學(xué)方法對(duì)產(chǎn)品檢測(cè)的包容性進(jìn)行研究，研究應(yīng)覆蓋權(quán)威數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的猴痘病毒核酸序列。

1.6.2驗(yàn)證具有時(shí)間和區(qū)域特征性的至少10個(gè)不同來(lái)源的陽(yáng)性樣本，包含分支 I、分支 II及分支 II的重點(diǎn)亞分支和其他重點(diǎn)分支（如有）。如分支I不可獲得，可采用假病毒進(jìn)行研究。研究應(yīng)包括檢出限和重復(fù)性的驗(yàn)證。

1.7檢出限

1.7.1檢出限的確定

建議將不同來(lái)源的至少3個(gè)樣本系列稀釋于與適用樣本一致的基質(zhì)中，進(jìn)行檢出限的確定。每個(gè)濃度梯度重復(fù)檢測(cè)，記錄不同濃度檢出的結(jié)果，采用適當(dāng)?shù)哪Ｐ停ㄈ鏟robit分析）和分析方法，將具有95%陽(yáng)性檢出率的最低濃度水平作為確定的檢出限。申請(qǐng)人可采用數(shù)字PCR、標(biāo)準(zhǔn)曲線等方法進(jìn)行毒株核酸濃度的確認(rèn)，以copies/mL作為毒株濃度的表示方式。此外還可采用半數(shù)組織感染量測(cè)定法（TCID50）的方法進(jìn)行毒株濃度確認(rèn)，以TCID50/mL作為毒株濃度的表示方式。如有計(jì)量學(xué)溯源的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，建議采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)建立校準(zhǔn)曲線的方法確定研究樣本的國(guó)際單位濃度。

1.7.2檢出限的驗(yàn)證

選擇另外3例不同來(lái)源的猴痘病毒樣本在檢出限濃度水平進(jìn)行驗(yàn)證，應(yīng)達(dá)到95%陽(yáng)性檢出率。

如檢測(cè)試劑包括多個(gè)可單獨(dú)報(bào)告的檢測(cè)靶標(biāo)，應(yīng)分別進(jìn)行LOD研究。

1.8分析特異性

1.8.1交叉反應(yīng)

生物信息學(xué)分析：采用生物信息學(xué)分析方法進(jìn)行研究，應(yīng)當(dāng)包括人基因組和其他近緣病毒、引起出疹癥狀等的其他病原體、適用樣本中可能存在的其他病原體。

樣本驗(yàn)證：交叉反應(yīng)研究樣品除特殊說(shuō)明外，應(yīng)采用滅活的臨床樣本或添加了滅活病原體培養(yǎng)物的陰性臨床樣本，樣本基質(zhì)應(yīng)與預(yù)期檢測(cè)樣本類型一致，交叉反應(yīng)研究用樣本主要考慮以下幾方面：

1.8.1.1其他近緣病毒：天花病毒（假病毒）、痘苗病毒、牛痘病毒、鼠痘病毒、傳染性軟疣病毒、特納河痘病毒（假病毒）、亞巴猴病毒（假病毒）等。

1.8.1.2引起出疹癥狀等的其他病原體：水痘-帶狀皰疹病毒、風(fēng)疹病毒、單純皰疹病毒-1/-2、人類皰疹病毒 6型、人類皰疹病毒 7型、人類皰疹病毒8型、麻疹病毒、腸道病毒、梅毒螺旋體、登革病毒、人乳頭瘤病毒等。

1.8.1.3適用樣本中可能存在的其他細(xì)菌/真菌等：金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、白色念珠菌、糞腸球菌、丙酸桿菌、類白喉?xiàng)U菌、銅綠假單胞菌、棒狀桿菌、大腸桿菌、生殖支原體、沙眼衣原體等。

1.8.1.4高濃度人類基因組DNA。

注：病毒培養(yǎng)液的濃度單位可采用TCID50或PFU/mL，細(xì)菌培養(yǎng)物濃度單位可采用CFU/mL。建議在病毒和細(xì)菌感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證。通常，細(xì)菌感染的水平為106 CFU/mL或更高，病毒為105 PFU/mL或更高。也可采用其他合理方法定值的濃度，例如核酸濃度107 copies/mL，如病原體樣本或培養(yǎng)物不能符合上述要求，申請(qǐng)人應(yīng)詳細(xì)說(shuō)明理由。對(duì)于某些難以培養(yǎng)或因?yàn)樯锇踩詿o(wú)法培養(yǎng)的病原體，可采用病原體核酸樣本進(jìn)行交叉驗(yàn)證。應(yīng)提供用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體核酸的來(lái)源、組成和濃度等信息，濃度可采用copies/mL單位表示。

申請(qǐng)人應(yīng)提供所有用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病毒和細(xì)菌的來(lái)源、種屬/型別信息和濃度確認(rèn)等試驗(yàn)資料。

1.8.2干擾試驗(yàn)

1.8.2.1內(nèi)源/外源物質(zhì)干擾

應(yīng)根據(jù)所采集樣本類型，針對(duì)可能存在的內(nèi)源/外源物質(zhì)干擾情況進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證推薦物質(zhì)見表1。建議申請(qǐng)人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度條件（“最差條件”）下進(jìn)行試驗(yàn)，檢測(cè)包含臨界陽(yáng)性水平在內(nèi)的猴痘病毒樣本。對(duì)結(jié)果進(jìn)行合理的統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)比添加干擾物質(zhì)前后的 Ct 值差異。檢測(cè)的潛在干擾物包括樣本中的原有物質(zhì)及在樣本采集和處理期間引入的物質(zhì)。

1.8.2.2病原體干擾

申請(qǐng)人應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品適用的樣本類型，充分考慮臨床上容易與猴痘病毒合并感染的病原體及“1.8.1”部分經(jīng)生物信息學(xué)分析顯示存在較高同源性的病原體，在高濃度的情況下對(duì)低濃度（例如檢出限濃度）猴痘病毒核酸檢測(cè)的影響，進(jìn)行易合并感染病原體的干擾研究。申請(qǐng)人也可結(jié)合臨床應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)（如發(fā)病率），對(duì)較高同源性的病原體對(duì)檢測(cè)試劑可能存在的干擾進(jìn)行分析。

1.9核酸提取/純化性能

對(duì)配合使用的所有核酸提取試劑進(jìn)行提取核酸純度、濃度、提取效率的研究，并與質(zhì)量較好的核酸提取試劑進(jìn)行平行比對(duì)。若產(chǎn)品適用兩種或以上核酸提取試劑，則每一種核酸提取試劑均需配合檢測(cè)試劑至少進(jìn)行抗干擾、再現(xiàn)性和檢出限的驗(yàn)證，如果配套核酸提取試劑提取原理存在差異，還需額外進(jìn)行檢出限的建立。

1.10反應(yīng)體系

1.10.1樣本采集和處理

根據(jù)適用樣本類型，進(jìn)行樣本采集研究。提供樣本采集器具材質(zhì)和保存液等的詳細(xì)研究資料，明確保存液或裂解液等的主要組成成分、使用量的要求等。配套采樣拭子研究資料應(yīng)包含拭子材質(zhì)選擇和拭子洗脫效果研究。配套的不同保存液或裂解液需驗(yàn)證檢出限和重復(fù)性。

提供樣本滅活、處理方式、處理過(guò)程的研究。

1.10.2核酸提取和反應(yīng)體系

研究確定最佳核酸提取和反應(yīng)體系，包括核酸提取用的樣本體積、洗脫體積和PCR加樣體積、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽(yáng)離子濃度及反應(yīng)各階段溫度、時(shí)間、循環(huán)數(shù)等。建議在保證核酸提取質(zhì)量的情況下盡量擴(kuò)大總反應(yīng)體系和加樣量，以提高檢測(cè)靈敏度。

提交不同適用機(jī)型基線和閾值循環(huán)數(shù)的確定資料。

不同適用機(jī)型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述，并提交驗(yàn)證資料。

2.穩(wěn)定性研究

申報(bào)試劑的穩(wěn)定性主要包括實(shí)時(shí)穩(wěn)定性（有效期）、開瓶穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性、機(jī)載穩(wěn)定性（如適用）及凍融次數(shù)限制等研究，申請(qǐng)人可根據(jù)實(shí)際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括具體的實(shí)施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)論。對(duì)于實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批產(chǎn)品在實(shí)際儲(chǔ)存條件下保存至成品有效期后的研究資料。對(duì)于開瓶穩(wěn)定性研究應(yīng)模擬真實(shí)使用情形，包括開瓶穩(wěn)定性的開瓶頻次和開瓶時(shí)間等。

3.陽(yáng)性判斷值研究

陽(yáng)性判斷值一般為申報(bào)產(chǎn)品檢測(cè)病毒核酸陽(yáng)性的Ct值。陽(yáng)性判斷值研究用樣本來(lái)源應(yīng)具有多樣性和代表性，考慮不同時(shí)間、地域、不同的感染階段和生理狀態(tài)等因素，盡量納入較多弱陽(yáng)性的樣本，陰性樣本應(yīng)包含易交叉病原體高濃度樣本。在條件允許的情況下，建議覆蓋目前的流行株進(jìn)行陽(yáng)性判斷值研究。如判定值存在灰區(qū)，應(yīng)提供灰區(qū)的確認(rèn)資料。

如果產(chǎn)品適用不同樣本類型，需要對(duì)各樣本類型進(jìn)行陽(yáng)性判斷值的驗(yàn)證。

提交陽(yáng)性判斷值研究所用樣本的背景信息列表，至少包括性別、年齡、臨床診斷信息、樣本來(lái)源機(jī)構(gòu)、檢測(cè)結(jié)果等信息。

提供內(nèi)標(biāo)檢測(cè)結(jié)果范圍的確定方法和研究資料。

4. 其他資料

4.1主要原材料研究資料

該類產(chǎn)品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTP、核酸分離/純化組分（如有）、質(zhì)控品、企業(yè)參考品等。應(yīng)提供主要原材料的選擇與來(lái)源、制備過(guò)程、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)研究資料、質(zhì)控品的定值試驗(yàn)資料等。如主要原材料為企業(yè)自制，應(yīng)提供其詳細(xì)制備過(guò)程；如主要原材料源于外購(gòu)，應(yīng)提供資料包括：選擇該原材料的依據(jù)及對(duì)比篩選試驗(yàn)資料、生產(chǎn)商提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢驗(yàn)報(bào)告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗(yàn)資料。生產(chǎn)商應(yīng)固定，不得隨意更換。

4.1.1引物和探針：應(yīng)詳述引物和探針的設(shè)計(jì)原則，提供引物、探針核酸序列、靶序列的基因位點(diǎn)及兩者的對(duì)應(yīng)情況。建議每種檢測(cè)靶標(biāo)設(shè)計(jì)兩套或多套引物、探針以供篩選，通過(guò)序列比對(duì)和功能性試驗(yàn)等方式，對(duì)病毒進(jìn)行包容性和特異性（如交叉反應(yīng)）的評(píng)價(jià)，其中序列比對(duì)包括與已公布猴痘病毒序列的比對(duì)，及與易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的其他病原體的序列比對(duì)；功能性試驗(yàn)包括對(duì)不同來(lái)源、不同滴度的猴痘病毒核酸陽(yáng)性樣本，和不同的近緣病原體的檢測(cè)。通過(guò)篩選確定最佳的引物和探針組合。引物、探針的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)至少包括序列準(zhǔn)確性、純度、濃度及功能性試驗(yàn)等。

4.1.2脫氧三磷酸核苷（dNTP）：包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP，應(yīng)提供對(duì)其純度、濃度、功能性等的詳細(xì)驗(yàn)證資料。

4.1.3酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶、尿嘧啶DNA糖基化酶等，應(yīng)分別對(duì)酶活性、功能性等進(jìn)行評(píng)價(jià)和驗(yàn)證。

4.1.4對(duì)照品

試劑盒一般包含陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品。陽(yáng)性對(duì)照品應(yīng)包含試劑盒檢測(cè)的靶序列，可采用假病毒或質(zhì)粒制備。對(duì)照品需參與樣本處理、核酸的平行提取和檢測(cè)的全過(guò)程，以對(duì)整個(gè)提取和PCR擴(kuò)增過(guò)程、試劑/設(shè)備、交叉污染等環(huán)節(jié)進(jìn)行合理質(zhì)量控制。提交試劑盒對(duì)照品有關(guān)原料選擇、制備、定值過(guò)程、濃度范圍等試驗(yàn)資料，應(yīng)對(duì)對(duì)照品的檢測(cè)結(jié)果Ct值范圍做出明確的要求。

4.1.5內(nèi)標(biāo)

內(nèi)標(biāo)，又稱內(nèi)對(duì)照，可對(duì)管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，應(yīng)與靶核酸一同提取及擴(kuò)增。申請(qǐng)人需對(duì)內(nèi)標(biāo)的引物、探針設(shè)計(jì)和相關(guān)反應(yīng)體系的濃度做精確驗(yàn)證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽(yáng)性曲線又要盡量降低對(duì)靶基因檢測(cè)造成的抑制。明確內(nèi)標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果Ct值范圍。建議科學(xué)設(shè)置內(nèi)標(biāo)，對(duì)待測(cè)樣本的取樣質(zhì)量、試劑的反應(yīng)體系進(jìn)行監(jiān)控。

4.1.6企業(yè)參考品

該類產(chǎn)品的企業(yè)參考品一般包括陽(yáng)性參考品、陰性參考品、檢出限參考品和精密度參考品。應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品性能驗(yàn)證的實(shí)際需要設(shè)置企業(yè)參考品。

應(yīng)提交企業(yè)參考品的原料來(lái)源、選擇、制備、陰陽(yáng)性及濃度確認(rèn)方法或試劑等相關(guān)驗(yàn)證資料。企業(yè)參考品應(yīng)采用滅活臨床樣本，或者使用病毒培養(yǎng)物加入陰性基質(zhì)。企業(yè)參考品的設(shè)置建議如下：

陽(yáng)性參考品：應(yīng)著重考慮不同來(lái)源的病毒樣本和濃度要求，應(yīng)至少選取不同來(lái)源的5個(gè)病毒樣本。

陰性參考品：主要涉及對(duì)交叉反應(yīng)的驗(yàn)證情況，建議包括水痘-帶狀皰疹病毒、風(fēng)疹病毒、單純皰疹病毒、人類皰疹病毒、天花病毒（假病毒）、痘苗病毒、牛痘病毒、化膿性鏈球菌、白色念珠菌等。

檢出限參考品：可采用95%陽(yáng)性檢出水平或略高于檢出限的水平，如100%陽(yáng)性檢出水平。

精密度參考品：建議包括高、低兩個(gè)濃度的樣本，其中一個(gè)濃度應(yīng)為檢出限附近的濃度。

4.2生產(chǎn)工藝研究資料

介紹產(chǎn)品主要生產(chǎn)工藝，可用流程圖結(jié)合文字的方式表述。提交主要生產(chǎn)工藝的確定及優(yōu)化研究資料。

（四）臨床評(píng)價(jià)資料

臨床試驗(yàn)的開展、方案的制定以及報(bào)告的撰寫等均應(yīng)符合相關(guān)法規(guī)及《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求，如相關(guān)法規(guī)、文件有更新，臨床試驗(yàn)應(yīng)符合更新后的要求。

1.臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)

建議申請(qǐng)人在相關(guān)流行病學(xué)多發(fā)區(qū)域選擇臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，應(yīng)是經(jīng)備案的醫(yī)療器械臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)（包括各級(jí)疾病預(yù)防控制中心）。臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)數(shù)量應(yīng)不少于3家，且具有分子生物學(xué)方法檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)有足夠的時(shí)間熟悉檢測(cè)系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)（儀器、試劑、質(zhì)控及操作程序等），熟悉評(píng)價(jià)方案。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，試驗(yàn)體外診斷試劑和對(duì)比方法均應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性。

2.臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.1 與對(duì)比方法/試劑的比較研究

2.1.1申請(qǐng)人可采用核酸序列測(cè)定方法作為參比方法，驗(yàn)證試驗(yàn)體外診斷試劑檢測(cè)結(jié)果與核酸序列測(cè)定（測(cè)序）結(jié)果之間的一致性。臨床研究中應(yīng)對(duì)選用的測(cè)序方法做詳細(xì)介紹，并對(duì)委托測(cè)序服務(wù)的機(jī)構(gòu)（如涉及）資質(zhì)和選擇依據(jù)作簡(jiǎn)要說(shuō)明或提供相關(guān)資料。

同時(shí)申請(qǐng)人應(yīng)進(jìn)行部分與病毒分離培養(yǎng)鑒定進(jìn)行比對(duì)的臨床試驗(yàn)。

2.1.2 如有已上市同類產(chǎn)品，臨床試驗(yàn)可選擇已上市的同類產(chǎn)品作為對(duì)比試劑，對(duì)比試劑的選擇應(yīng)考慮樣本類型、產(chǎn)品性能等方面應(yīng)與試驗(yàn)體外診斷試劑具有良好的可比性。

2.2 與臨床參考標(biāo)準(zhǔn)的比較研究

除上述比對(duì)試驗(yàn)外，還應(yīng)考慮試驗(yàn)體外診斷試劑與臨床參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)比。臨床參考標(biāo)準(zhǔn)即按照國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的《猴痘診療指南》及《猴痘防控方案》等文件進(jìn)行病例診斷的方法。

3.臨床試驗(yàn)入組人群

臨床試驗(yàn)的入組人群應(yīng)為產(chǎn)品的預(yù)期適用人群，該產(chǎn)品的適用人群為猴痘的疑似病例，申請(qǐng)人在進(jìn)行臨床試驗(yàn)時(shí)應(yīng)依據(jù)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的《猴痘診療指南》中對(duì)“疑似病例”的定義，按照該定義入組病例進(jìn)行臨床研究。同時(shí)還應(yīng)入組部分需要進(jìn)行鑒別診斷的其它發(fā)熱出疹性疾病，如水痘、帶狀皰疹、單純皰疹、登革熱等進(jìn)行特異性的評(píng)價(jià)。如試驗(yàn)體外診斷試劑包括血液樣本類型，應(yīng)注意針對(duì)該樣本類型，入組人群應(yīng)為急性期發(fā)病7日內(nèi)的病例。

4.臨床試驗(yàn)樣本類型

臨床樣本的采集建議按照《猴痘病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南》進(jìn)行。

如申報(bào)產(chǎn)品適用于不同的樣本類型，如皮膚病變樣本（包括皮疹表面和/或滲出物的拭子；痘皰液；痘痂或痘皰皮膚黏膜樣本等）、咽拭子、血液樣本，應(yīng)在臨床試驗(yàn)中分別進(jìn)行臨床評(píng)價(jià)。樣本類型的選擇，應(yīng)參考國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的《猴痘診療指南》及《猴痘病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南》等文件的相關(guān)要求。

5.臨床試驗(yàn)樣本量

與對(duì)比方法/試劑比較研究的臨床試驗(yàn)樣本量應(yīng)滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，可采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行估算。臨床試驗(yàn)可依據(jù)試驗(yàn)用體外診斷試劑相對(duì)于對(duì)比方法的陰陽(yáng)性符合率分別估算最低陰陽(yáng)性樣本例數(shù)。

臨床樣本量的估算建議采用如下樣本量公式計(jì)算，

公式中，n為樣本量；Z1-α/2、Z1-β為顯著性水平和把握度的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的分?jǐn)?shù)位，P0為評(píng)價(jià)指標(biāo)的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)，PT為試驗(yàn)體外診斷試劑評(píng)價(jià)指標(biāo)預(yù)期值。其中，陰陽(yáng)性符合率的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)（P0）建議不低于90%。

如申報(bào)試劑包含不同樣本類型，建議針對(duì)皮膚病變樣本、咽拭子、血液樣本分別按照上述方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)估算。應(yīng)注意每種皮膚病變樣本均應(yīng)有一定陽(yáng)性例數(shù)。

病毒分離培養(yǎng)應(yīng)入組一定數(shù)量的陽(yáng)性及陰性病例，考察試驗(yàn)體外診斷試劑與病毒分離培養(yǎng)結(jié)果的一致性，納入的例數(shù)也應(yīng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)估算，可采用抽樣精度的公式進(jìn)行樣本量估算。

與臨床參考標(biāo)準(zhǔn)的比較研究，建議參考與對(duì)比方法/試劑比較研究部分的樣本量估算方法，設(shè)定合理的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)。

6.臨床試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析

此類產(chǎn)品的臨床試驗(yàn)?zāi)康脑谟隍?yàn)證試驗(yàn)體外診斷試劑與已上市同類產(chǎn)品/對(duì)比方法及臨床參考標(biāo)準(zhǔn)的一致性，統(tǒng)計(jì)分析一般以四格表的形式對(duì)結(jié)果進(jìn)行總結(jié)，并據(jù)此計(jì)算試驗(yàn)體外診斷試劑與對(duì)比方法的陽(yáng)性/陰性符合率、臨床靈敏度/臨床特異度及其95%置信區(qū)間。應(yīng)將試驗(yàn)體外診斷試劑與對(duì)比方法檢測(cè)結(jié)果一致性、試驗(yàn)體外診斷試劑檢測(cè)結(jié)果與臨床參考標(biāo)準(zhǔn)的一致性、試驗(yàn)體外診斷試劑檢測(cè)結(jié)果與病毒分離培養(yǎng)鑒定結(jié)果的一致性分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以評(píng)價(jià)產(chǎn)品臨床性能。

臨床試驗(yàn)建議對(duì)入組人群的人口學(xué)進(jìn)行分析，包括年齡、性別、臨床診斷背景等。臨床試驗(yàn)中包含不同樣本類型的，應(yīng)在總體統(tǒng)計(jì)分析的基礎(chǔ)上，每個(gè)樣本類型分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。應(yīng)注意，與臨床參考標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)計(jì)分析中，一個(gè)病例僅可納入一例樣本。

臨床試驗(yàn)中所有不一致結(jié)果均應(yīng)結(jié)合患者的流行病學(xué)背景、臨床癥狀、疾病轉(zhuǎn)歸等信息進(jìn)行充分的分析。

7.境外臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)的認(rèn)可

境外臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)符合《接受醫(yī)療器械境外臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)技術(shù)指導(dǎo)原則》和《使用體外診斷試劑境外臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)的注冊(cè)審查指導(dǎo)原則》的相關(guān)要求。提交完整的臨床試驗(yàn)方案、報(bào)告和倫理審查意見，以及該數(shù)據(jù)適用于中國(guó)患者人群的論證資料、境內(nèi)外臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理差異的對(duì)比資料和臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理差異對(duì)于臨床試驗(yàn)結(jié)果影響的論證資料。

注冊(cè)申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)上述臨床試驗(yàn)技術(shù)審評(píng)要求，論證境外臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)的充分性。

8.臨床證據(jù)的形式要求

申請(qǐng)人應(yīng)按照《體外診斷試劑注冊(cè)與備案管理辦法》《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》等法規(guī)文件要求提交各機(jī)構(gòu)倫理審查意見、臨床試驗(yàn)方案、臨床試驗(yàn)小結(jié)、臨床試驗(yàn)報(bào)告以及臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)庫(kù)。

臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)表作為臨床試驗(yàn)報(bào)告的附件提交。數(shù)據(jù)表中應(yīng)包括檢測(cè)病例的編號(hào)、年齡、性別、樣本類型、臨床診斷結(jié)果、發(fā)病時(shí)間、采樣時(shí)間、試驗(yàn)體外診斷試劑檢測(cè)結(jié)果（含各基因的Ct值）、對(duì)比方法的檢測(cè)結(jié)果（如各基因的Ct值）等。臨床應(yīng)用的數(shù)據(jù)集中每一病例編號(hào)應(yīng)能夠溯源。

關(guān)于測(cè)序試驗(yàn)，申請(qǐng)人應(yīng)提供關(guān)于測(cè)序部分的詳細(xì)試驗(yàn)資料，包括測(cè)序方法的建立及驗(yàn)證資料，需由臨床試驗(yàn)單位簽章確認(rèn)。

（五）產(chǎn)品說(shuō)明書和標(biāo)簽樣稿

產(chǎn)品說(shuō)明書格式應(yīng)滿足《體外診斷試劑說(shuō)明書編寫指導(dǎo)原則》的要求。產(chǎn)品說(shuō)明書中技術(shù)內(nèi)容應(yīng)與注冊(cè)申報(bào)資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，應(yīng)以規(guī)范格式進(jìn)行標(biāo)注，并單獨(dú)列明文獻(xiàn)的相關(guān)信息。猴痘病毒核酸檢測(cè)試劑說(shuō)明書編寫應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注以下內(nèi)容。

1．【預(yù)期用途】

本試劑盒用于體外定性檢測(cè)猴痘疑似病例、其他需要進(jìn)行猴痘病毒感染診斷或鑒別診斷者的xx樣本中猴痘病毒核酸。

有關(guān)“疑似病例”等人群的定義參照《猴痘診療指南》及《猴痘防控方案》等文件執(zhí)行。

該產(chǎn)品在使用上應(yīng)當(dāng)遵守《猴痘診療指南》及《猴痘防控方案》等文件的相關(guān)要求。

開展猴痘病毒核酸檢測(cè)，應(yīng)符合《猴痘病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南》等的要求，做好生物安全工作。

本試劑盒檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考，不得作為臨床診斷的唯一標(biāo)準(zhǔn)。建議結(jié)合患者臨床表現(xiàn)和其他實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)對(duì)病情進(jìn)行綜合分析。

2.【檢驗(yàn)原理】

簡(jiǎn)述產(chǎn)品的核酸提取和擴(kuò)增原理，檢測(cè)能夠覆蓋的目標(biāo)基因序列特征。明確內(nèi)標(biāo)基因名稱及其作用。如采用了防污染措施，進(jìn)行簡(jiǎn)要描述。

3.【主要組成成分】

明確試劑盒中各組分及具體成分。明確需要但未提供的材料，例如核酸提取試劑，病毒保存液等的產(chǎn)品名稱，注冊(cè)人（備案人），貨號(hào)及注冊(cè)證號(hào)、備案號(hào)等信息。

4.【樣本要求】

需詳細(xì)描述樣本采集和處理方式，包括采樣步驟，適用的拭子材質(zhì)（如適用），保存液及使用體積、適用的抗凝劑類型（如適用），滅活方式等。描述樣本及核酸提取液的保存穩(wěn)定性。

5.【檢驗(yàn)方法】

明確核酸提取用的樣本體積、洗脫體積和PCR加樣體積，陰、陽(yáng)性對(duì)照品與待測(cè)樣本同步進(jìn)行核酸提取操作。明確各適用機(jī)型的反應(yīng)參數(shù)設(shè)置。明確對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果Ct值范圍，作為實(shí)驗(yàn)有效性的標(biāo)準(zhǔn)。

6.【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

通過(guò)擴(kuò)增曲線和Ct值進(jìn)行結(jié)果陰陽(yáng)性的判斷，列明結(jié)果陰性、陽(yáng)性、復(fù)測(cè)、無(wú)效等所有情形。

7.【檢驗(yàn)方法的局限性】

7.1本試劑盒的檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考，對(duì)患者的臨床診治應(yīng)結(jié)合其癥狀/體征、病史、其他實(shí)驗(yàn)室檢查及治療反應(yīng)等情況綜合考慮。

7.2有關(guān)假陽(yáng)性結(jié)果的可能性分析

7.2.1如果樣本在運(yùn)輸、處理過(guò)程中發(fā)生交叉污染，則可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果；

7.2.2實(shí)驗(yàn)環(huán)境有PCR產(chǎn)物等氣溶膠污染，則可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果；

7.2.3實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的耗材、設(shè)備等受污染，則可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。

7.3有關(guān)假陰性結(jié)果的可能性分析

7.3.1不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)、儲(chǔ)存及處理、樣本中病原體含量過(guò)低均有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

7.3.2該病原體待測(cè)靶序列的變異或其他原因?qū)е碌男蛄懈淖兛赡軙?huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

7.3.3未經(jīng)驗(yàn)證的其他干擾或PCR抑制因子等可能會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

8.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

簡(jiǎn)述以下性能指標(biāo)：

8.1國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（如有）和企業(yè)參考品的符合率。

8.2檢出限：簡(jiǎn)要介紹評(píng)價(jià)方法、所用樣本情況以及評(píng)價(jià)結(jié)果。

8.3對(duì)包容性的研究情況進(jìn)行總結(jié)。包括不同（亞）分支樣本的檢出限和重復(fù)性性能并描述猴痘病毒生物信息學(xué)分析結(jié)果。

8.4對(duì)精密度的研究情況進(jìn)行總結(jié)。

8.5分析特異性

8.5.1交叉反應(yīng)：詳述交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體種類，及有/無(wú)交叉反應(yīng)的濃度水平。

8.5.2干擾試驗(yàn)：說(shuō)明驗(yàn)證的干擾物質(zhì)種類及有/無(wú)干擾反應(yīng)的濃度水平。

8.6臨床試驗(yàn)：簡(jiǎn)要介紹試驗(yàn)方法、受試者及樣本、試驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論等。

9.【注意事項(xiàng)】

9.1本產(chǎn)品僅用于體外診斷。

9.2臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法》等有關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室要求。

9.3試劑保存運(yùn)輸及使用過(guò)程中多種因素可能導(dǎo)致性能變化，如保存運(yùn)輸不當(dāng)、樣本采集、樣本處理及檢測(cè)過(guò)程操作不規(guī)范等，請(qǐng)嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作。因拭子等樣本采集過(guò)程及病毒感染過(guò)程本身的特點(diǎn)，可能存在采集到的樣本量不足等原因帶來(lái)的假陰性結(jié)果，應(yīng)結(jié)合臨床其他診療信息綜合判斷，必要時(shí)復(fù)測(cè)。

9.4生物安全防護(hù)相關(guān)內(nèi)容

9.5避免實(shí)驗(yàn)室污染的措施

三、參考文獻(xiàn)

1.《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》（國(guó)家藥品監(jiān)督管理局公告2021年第122號(hào)）[Z].

2.《定性檢測(cè)體外診斷試劑分析性能評(píng)估注冊(cè)審查指導(dǎo)原則》（國(guó)家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心通告2022年第36號(hào)）[Z].

3.《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》（國(guó)家藥品監(jiān)督管理局公告2021年第72號(hào)）[Z].

4.中華人民共和國(guó)衛(wèi)生健康委員會(huì).猴痘診療指南（2022年版） [Z]2022-06-10

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6.《接受醫(yī)療器械境外臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)技術(shù)指導(dǎo)原則》（原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2018年第13號(hào)）[Z].

7.《使用體外診斷試劑境外臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)的注冊(cè)審查指導(dǎo)原則》（國(guó)家藥品監(jiān)督管理局公告2021年第95號(hào)）[Z].

8.《體外診斷試劑注冊(cè)與備案管理辦法》（國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局令第48號(hào)）[Z].

9.《體外診斷試劑說(shuō)明書編寫指導(dǎo)原則（2023年修訂版）》（國(guó)家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心通告2024年第1號(hào)）[Z].

10.《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號(hào)）[Z].