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人紅細胞反定型試劑注冊技術審查指導原則（2016年第131號）

本指導原則旨在指導注冊申請人對人紅細胞反定型試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門審評注冊申報資料提供參考。

本指導原則是對人紅細胞反定型試劑的一般要求，申請人應依據產品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據，并依據產品的具體特性對注冊申報資料的內容進行充實和細化。

本指導原則是供申請人和審查人員使用的指導文件，不涉及注冊審批等行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如有能夠滿足法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但應提供詳細的研究資料和驗證資料。應在遵循相關法規(guī)的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現(xiàn)行法規(guī)、標準體系及當前認知水平下制定的，隨著法規(guī)、標準體系的不斷完善和科學技術的不斷發(fā)展，本指導原則相關內容也將適時進行調整。

一、范圍

人紅細胞反定型試劑用于人ABO血型的反定型，測定被檢者血清中有無相應的抗A或抗B抗體，輔助正定型結果判斷ABO血型。

本指導原則適用于人紅細胞反定型試劑，同時適用于不同的檢測方法,如試管法、柱凝集法、微孔板法等，但不適用于血源篩查用人紅細胞反定型試劑。

本指導原則僅包括對人反定型紅細胞試劑注冊申報資料中部分項目的要求，適用于進行產品注冊和相關許可事項變更的產品。其他未盡事宜，應當符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號）（以下簡稱《辦法》）等相關法規(guī)要求。

二、基本要求

（一）綜述資料

綜述資料的撰寫應符合《關于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第44號）（以下簡稱“44號公告”）的相關要求。內容主要包括產品預期用途、產品描述、有關生物安全性的說明、有關產品主要研究結果的總結和評價以及同類產品在國內外批準上市的情況介紹等內容，其中同類產品上市情況介紹部分應著重從抗原性、特異性、親和力、溶血率、有效期等方面寫明擬申報產品與目前市場上已獲批準的同類產品之間的異同。

（二）主要原材料研究資料

主要原材料研究資料應包括主要組成成分（紅細胞及細胞保存液成分等）的選擇、制備及其質量標準的研究資料。

1.紅細胞的選擇及質量標準。需詳細描述紅細胞的來源。紅細胞來源應穩(wěn)定、可靠，采集時間期限明確。紅細胞的選擇應遵循以下原則：

（1）如紅細胞Rh表型為陽性(D+、C+、E+)，則應在A1、B紅細胞外增加Rh陽性的O型紅細胞。

（2）如只包含A1、B紅細胞，則兩支紅細胞均應為Rh表型陰性（D-、E-、C- ）的混合細胞懸液。

應對試劑紅細胞進行以下基本特性的研究：

紅細胞獻血員應進行血型正反定型檢測，只有在正反定型結果一致的情況下，其紅細胞才能用于生產。

①紅細胞的抗原性：反定型紅細胞至少要包括A1和B細胞，使用A2和O細胞測定可解決部分血型測定中的異常情況，A2細胞可測定A亞型，O細胞可在測定中作為抗原陰性對照。

②紅細胞的抗原強度：通過考察不同凝集強度時抗體試劑（抗-A、抗-B、抗-H）的稀釋度，說明試劑紅細胞的抗原強度。

③親和力：通過與相應抗體（抗-A、抗-B、抗-H）反應在多少秒（如15秒）內出現(xiàn)凝集，3分鐘內凝集塊達到1mm2以上（或凝集強度≥3+）等指標體現(xiàn)細胞親和力，可參照相關規(guī)定進行試驗及結果判斷?？贵w效價應符合國家規(guī)定。

④紅細胞的特異性：使用抗-A、抗-A1抗-B、抗-H抗體進行特異性驗證。不與ABO血型系統(tǒng)非對應抗體發(fā)生陽性反應。

⑤直接抗人球蛋白試驗：使用抗-IgG和抗-補體或使用多特異性抗人球蛋白試劑對試劑紅細胞進行直接抗人球蛋白試驗（DAT）時，結果應為陰性。

⑥溶血率（性）：明確溶血率的試驗方法、實驗所需物品及溶血率的要求?？刹捎萌苎驶蛴坞x血紅蛋白濃度的作為評價指標。

⑦紅細胞濃度的確定：說明紅細胞懸浮液的濃度和限度（如3%±0.2%）。

2.紅細胞保存液的選擇：說明紅細胞保存液的選擇過程，提交試驗數據說明最終確定的保存液在保證細胞的抗原性（抗原減弱）、減少溶血等方面的性能。需明確保存液中各組分的基本作用，如何防止溶血、抗原減弱、補體激活等。另外應對紅細胞保存液的以下性能進行研究：

（1）PH值。

（2）在選定的保存液環(huán)境中進行試劑紅細胞穩(wěn)定性的研究，進行詳細的效期穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性的研究。

3.生物安全性。

（三）主要生產工藝及反應體系的研究資料

1.主要生產工藝介紹，可用流程圖方式表示，并簡要說明主要生產工藝的確定依據。

2.產品基本反應原理介紹。

3.主要生產工藝過程的研究資料、每一步生產工藝的確認資料及試驗數據。

4.主要反應體系（不同的實驗原理、實驗方法）的研究資料、每一步反應體系的確認資料及試驗數據。

反應體系的設置應符合《全國臨床檢驗操作規(guī)程》等公認標準操作規(guī)范、指南或標準的要求。

（四）分析性能評估資料

申請人應提交生產者在產品研制或成品驗證階段對試劑進行的所有性能驗證的研究資料，對于每項分析性能的評價都應包括具體研究目的、實驗設計、研究方法、可接受標準、實驗數據、統(tǒng)計方法等詳細資料。有關分析性能驗證的背景信息也應在申報資料中有所體現(xiàn)，包括實驗地點（實驗室）、適用儀器、試劑規(guī)格、批號、臨床樣本來源等。分析性能評估的實驗方法可以參考國內或國際有關體外診斷產品性能評估的指導原則進行。

產品性能研究所采用的各種儀器、試劑或其他物品如可能均應采用境內或境外已批準上市的產品，如抗A、抗B 、抗H、抗人球蛋白試劑等。

分析性能評估試驗中應明確所有試驗每種試劑的用量、試劑紅細胞的濃度、采用的試驗方法（試管法、柱凝集法、微孔板法等）。所有試驗方法應符合配合使用的血型試劑的具體操作要求。

應對申報的反定型紅細胞試劑聲稱適用的所有試驗方法進行分析性能評估，如試管法、柱凝集法、微孔板法等。不同試驗方法的性能研究均應采用至少三批產品進行。對于人紅細胞反定型試劑，建議著重對以下分析性能進行研究：

1.紅細胞的抗原性：以表1的反應格局說明紅細胞的抗原性。

2.紅細胞的抗原強度：紅細胞的抗原強度應不低于表2要求。

3.親和力

抗-A、抗-B、抗-H與試劑紅細胞A1、A2、B、O混合后，應在多少秒內（如15秒內）出現(xiàn)肉眼可見的凝集，3分鐘內凝集塊達到1mm2以上（或凝集強度≥3+）。

4.紅細胞的特異性：以表3的反應格局說明紅細胞的特異性。

5.直接抗人球蛋白試驗

使用抗-IgG和抗-補體或多特異性抗人球蛋白試劑進行試劑紅細胞直接抗人球蛋白試驗時，結果應為陰性。

6.溶血率（性）

明確每種試劑紅細胞溶血率的試驗方法、使用物品、測量方法、結果計算方法等內容。

可采用百分比進行結果報告，也可采用濃度單位報告結果。

7.樣本抗凝劑的選擇。

8.溶血、脂血、黃疸等樣本的干擾評價。

9.無菌試驗。

（五）陽性判斷值

給出不同凝集強度的研究方法，并明確不同凝集強度代表的具體意義，并應包含溶血、混合視野雙群等情況，明確具體的試驗方法、實驗步驟，提供不同凝集強度的圖例或相片。

（六）穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內容，申報紅細胞試劑的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。前者主要包括實時穩(wěn)定性（有效期）、運輸穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性等研究，申請人可根據實際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案，實驗項目應至少包括紅細胞抗原性、凝集強度、特異性、溶血率、無菌試驗。

穩(wěn)定性研究資料應包括研究方法的確定依據、具體的實施方案、詳細的研究數據以及結論。對于實時穩(wěn)定性研究，應提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

應對樣本穩(wěn)定性進行研究，主要包括室溫保存、冷藏和冷凍條件下的有效期驗證，可以在合理的溫度范圍內選擇溫度點（溫度范圍），每間隔一定的時間段對儲存樣本進行全性能的分析驗證，從而確認不同類型樣本的穩(wěn)定性。適于冷凍保存的樣本還應對凍融次數進行評價。

試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性兩部分內容的研究結果應分別在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】兩項中進行詳細說明。

（七）臨床試驗

臨床試驗總體要求及臨床試驗資料的內容應符合《體外診斷試劑臨床試驗指導原則》《辦法》、“44號公告”的規(guī)定，以下僅結合人紅細胞反定型試劑的具體特點對其臨床試驗中應重點關注的內容進行闡述。

1.研究方法

該類試劑已有同類產品上市，按照法規(guī)要求應選擇境內已批準上市、臨床普遍認為質量較好的同類產品作為對比試劑，采用試驗用體外診斷試劑（以下稱考核試劑）與之進行比較研究試驗，證明本品與已上市產品等效。

2.臨床試驗單位的選擇

應選擇符合法規(guī)要求的臨床試驗機構進行臨床試驗，不得選擇血站或采供血機構進行臨床試驗。

3.病例選擇

臨床總病例數應不少于3000例。應采用臨床患者進行臨床研究，應包括對反定型檢測易產生干擾的病例，如選擇各種疾病患者（腫瘤患者、自身免疫病患者、血液病患者等）、老人、兒童（不同年齡段）、正反定型不一致的病例等。

4.試驗過程

在進行反定型紅細胞試劑臨床試驗的過程中除與對比試劑進行比較外，應同時給出該樣本的正定型試驗結果，以進一步判斷反定型結果的準確性。

產品如適用于不同的試驗方法（如試管法、柱凝集法、微孔板法等），每種試驗方法均應分別進行至少3000例的臨床試驗，并明確配合使用的試劑產品，配合使用的產品均應是境內已上市產品。

5.統(tǒng)計學分析

應分別進行正反定型結果、考核試劑與對比試劑的陽性符合率、陰性符合率、總符合率的計算，并以四格表的形式進行列表，并對定性結果進行Kappa檢驗以驗證檢測結果的一致性。

6.結果差異樣本的驗證

對于兩種試劑檢測結果不一致（包括正反定型結果不一致、考核試劑與對比試劑結果不一致、與對比試劑凝集強度差異較大）的樣本，應采用臨床上公認較好的第三種同類試劑進行確認試驗，同時應結合樣本的正定型結果進行綜合分析，最終應采用適合的方法進行樣本血型的最終確認。

7.臨床試驗數據記錄表應作為臨床試驗報告附件提交。臨床試驗數據記錄表應列明所有病例的具體臨床診斷信息、凝集強度和血型正反定型結果，如有不符樣本應列明第三方確認的結果。

（八）產品風險分析資料

產品風險分析資料應符合“44號公告”的基本要求，并參照相應的行業(yè)標準進行風險分析。風險分析中應充分考慮到各種可能影響檢測結果的因素，如某些樣本（如腫瘤患者、自身免疫病患者、血液病患者等）在進行血型反定型檢測時可能存在一定的干擾、影響試劑紅細胞穩(wěn)定性的諸多因素可能導致的細胞抗原性減弱、新生兒或老年人可能因為抗體較弱影響檢測結果等，申請人應根據這些不確定的因素分析產品應用可能存在的風險。

（九）產品技術要求

申請人應當在原材料質量和生產工藝穩(wěn)定的前提下，根據產品研制、性能評估等結果，依據國家標準、行業(yè)標準及有關文獻，按照《醫(yī)療器械產品技術要求編寫指導原則》的有關要求，編寫產品技術要求。產品技術要求應符合《辦法》和“44號公告”的相關規(guī)定。

如果擬申報試劑已有相應的國家/行業(yè)標準發(fā)布，則企業(yè)標準的要求不得低于上述標準要求。

產品技術要求的性能指標應至少包括紅細胞的抗原性、紅細胞的抗原強度、紅細胞的特異性、直接抗人球蛋白試驗、溶血率（性）、親和力。

（十）產品注冊檢驗報告

根據《辦法》要求，申請注冊的第三類體外診斷試劑應在國家食品藥品監(jiān)督管理總局認可的、具有相應承檢范圍的醫(yī)療器械檢驗機構進行連續(xù)三個生產批次樣品的注冊檢驗。

（十一）產品說明書

說明書承載了產品預期用途、試驗原理、試驗方法、檢測結果解釋以及注意事項等重要信息，是指導實驗室工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對檢驗結果給出合理醫(yī)學解釋的重要依據，因此，產品說明書是體外診斷試劑注冊申報最重要的文件之一。產品說明書的格式應符合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》的要求，境外產品的中文說明書除格式要求外，其內容應盡量保持與原文說明書的一致性，翻譯力求準確且符合中文表達習慣。產品說明書的所有內容均應與申請人提交的注冊申報資料中的相關研究結果保持一致，如某些內容引用自參考文獻，則應以規(guī)范格式對此內容進行標注，并單獨列明參考文獻的相關信息。

以下內容僅對人紅細胞反定型試劑說明書的重點內容進行詳細說明，說明書其他內容應根據《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》要求進行編寫。

1.【預期用途】

（1）寫明本試劑用于人血型的反定型檢測，同時明確不用于血源篩查，僅用于臨床檢驗。

（2）明確產品的檢測結果必須結合正定型的檢測結果才能進行ABO血型的準確定型。

（3）說明與預期用途相關的臨床適應癥背景情況，說明相關的臨床或實驗室診斷方法。

2.【儲存條件及有效期】

說明試劑的儲存條件及有效期、開瓶穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性等。

3.【樣本要求】

明確溶血、脂血、黃疸樣本是否可以使用，或提供使用此類樣本的最低要求。依據穩(wěn)定性研究結果寫明樣本穩(wěn)定性。

明確適用的抗凝劑的要求。

明確具體的樣本采集、處理方法及過程。

4.【陽性判斷值】

明確各種試驗方法的結果判斷方法及標準，并通過不同凝集強度的圖例或照片進行詳細解釋。

5.【檢驗方法】

如適用于不同的試驗方法請分別寫明具體方法及操作步驟。如配合其他試劑進行試驗，需注明試驗方法應完全符合配合試劑的試驗操作要求。

質控要求：為確保試劑測定的準確性，每天要使用已知弱反應性抗血清測定試劑細胞的反應性。每次測定時用自身細胞進行同步對照是有意義的。應根據相關規(guī)定進行每日質控試驗。

6.【檢驗方法的局限性】

（1）老年人及兒童ABO 抗體弱，某些疾病患者如腫瘤、多發(fā)性骨髓瘤、消化道疾病等反定型會出現(xiàn)弱反應，甚至陰性反應，結果應慎重解釋。

（2）必須與正定型血型檢測同時進行，正反定型結果一致才能確定ABO血型。正反定型不一致時需要進一步檢測，單獨的反定型結果不能作為判斷ABO血型的依據。

（3）絕大多數A、B和O型血的ABO抗體凝集強度均較強，如凝集強度為2+以下，應對弱陽性反應進行確認，以排除干擾或亞型，確保正確的ABO定型。